近年来随着生物技术的技术不断发展，出现了许多克隆新基因的技术方法和手段，如图谱克隆技术、技术转座子标签技术、技术mRNA差异显示技术、技术基因组减法技术以及cDNA文库筛选技术等。技术

定义

但上述方法大多具有实验周期长、技术技术步骤烦琐且工作量大等特点。技术cDNA末端快速扩增技术（rapid amplification of cDNA ends，技术RACE）是技术一种基于PCR从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5'和3'末端的有效方法，以其简单、技术快速、技术廉价等优势而受到越来越多的技术重视。

改进

对传统RACE技术的技术改进主要是引物设计及RT-PCR技术的改进：

改进之一是利用锁定引物((lockdockingprimer)合成第一链cDNA,即在oligo(dT)引物的3′端引入两个简并的核苷酸【5′-Oligo(dT)16_30MN-3′,M=A/G/C;N=A/G/C/T】，使引物定位在poly(A)尾的技术起始点，从而消除了在合成第一条cDNA链时oligo(dT)与poly(A)尾的任何部位的结合所带来的影响；

cDNA末端快速扩增(RACE)技术可以快速扩增mRNA3'和5'末端,从而获得全长的cDNA序列,为分离和研究新的基因提供了一个快速简便的方法。[1]

改进之二是在5‘端加尾时，采用poly(C)，而不是poly(A)；

改进之三是采用RNaseH一莫洛尼氏鼠白血病毒(MMLV)反转录酶或选择嗜热DNA聚合酶可能在高温h(60度-70度)有效地逆转录mRNA，从而消除了5‘端由于高CC含量导致的mRNA二级结构对逆转录的影响；改进之四是采用热启动PCR(hotstartPCR)技术和降落PCR(touchdownPCR)提高PCR反应的特异性。

主要分类

一般分5-和3-RACE两种。

3-RACE较简单，首先将mRNA或总RNA用PolyT引物反转录，根据一般基因具有polyA尾巴的特点，选用特异引物(根据已知序列设计)和PolyT引物PCR即可。大多实验者反映一次PCR可以搞定。

5-RACE相对较难，目前流行几种5-RACE。其一为加接头(传统)，根据接头引物和自己设计特异引物PCR，可以设计巢式PCR二次扩增。另外，有利用反向PCR技术，连接成环在PCR。还有，GENE公司一种smartRACEPCR，利用反转酶末断加C特点,直接加上多G接头，转换模板而无需用连接酶加接头。

引物设计

基因特异性引物（GSPs）应该是：

1.23－28nt

2.50－70％GC

3.Tm值≥65度，Tm值≥70度可以获得好的结果需要实验者根据已有的基因序列设计5‘和3‘RACE反应的基因特异性引物（GSP1和GSP2).由于两个引物的存在，PCR的产物是特异性的。

4.cDNA的合成起始于polyA+RNA。如果使用其它的基因组DNA或总RNA，背景会很高。

5.RACEPCR的效率还取决于总的mRNA中目的mRNA的量和不同的引物有不同的退火和延伸温度。

6.在进行5‘和3’RACEPCR的时候应该使用热启动。

7.重叠引物的设计会对全长的产生有帮助。另外，重叠的引物可以为PCR反应提供一个对照。并不是绝对的要利用设计的引物产生重叠片段。

8.引物GSP中的GC含量要在50－70％之间。这样可以使用降落PCR。避免使用自身互补性的引物序列，否则会产生回折和形成分子内氢键。另外，避免使用与AP1互补的引物，尤其是在3‘末端。

9.如果要用重叠片段来检测设计的引物，GSp1和GSp2之间至少是100－200碱基。只有这样才可以用扩增的产物来鉴定设计的引物是否正确。

10.降落PCR可以明显的增加RACEPCR产物的特异性。在最开始的循环中，退火温度高于AP1引物的Tm值，可以增加对特异性条带的扩增。随后的退火和延伸的温度降回到AP1的温度，可以进行随后的PCR循环。

11.验证基因特异性引物的对照：

单个引物的阴性对照：只用一个引物GSP来进行阴性对照。这样不应该产生任何的条带。如果可以看到明显的产物，应该改变循环的参数，或重新设计原始引物。

利用两个GSPS进行阳性对照：（只有两个GSP可以产生重叠的时候才可以采用此步。）为了确定RNA样品中目的基因确实表达，利用两个GSP和接头连接的cDNA来产生阳性对照。可以产生两个引物之间的重叠大小的片段。如果没有这个片段，应该重复cDNA的合成，或者从一个不同的组织或细胞来源进行cDNA的合成。

12.制备和抽提polyA+RNA不要使用DEPC处理过的水。纯化完mRNA之后，利用琼脂糖凝胶电泳检测mRNA的质量。哺乳动物的mRNA样品是0.5－12kb的拖带，在其中有4.5和1.9kb的rRNA的条带。非哺乳动物的mRNA应略小。

比较与优化

目的：研究环化法、末端脱氧核糖核酸转移酶法和SMART反转录酶法3种常用5'RACE的技术的特点，并对它们进行了优化。

方法：以播娘蒿RNA为模板，先按文献标准方法进行5'RACE，然后通过增加反应时间，提高部分反应物浓度等方法进行优化。

结果：未优化前环化法和TdT酶法条带几乎不可见，SMART反转录酶法隐约可见条带，但不清晰。优化条件后，环化法出现弥散条带，TdT酶法胜之，但条带依旧弥散，而SMART反转录酶法最佳，获得清晰特异性条带。结论SMART5'RACE效果最好，其次为TdT酶法，环化法效果有待改进，同时通过优化条件可以明显增加产物的特异性，为实验研究中5'RACE方法的选择提供了依据。

实验步骤

cDNA第一条链的合成：

我们建议进行cDNA合成的对照反应，这样可以对样品的cDNA的合成进行鉴定。加入各种试剂之后，在气浴中42度保温一个小时。

注意：在水浴或酒精浴中保温回减少反应体积，从而降低第一链的合成效率。将管放于冰上，以终止第一链的合成反应。直接进行第二链的合成。

cDNA第二链的合成：

第二链合成的酶混合物中，含有聚合酶、RNaseH和连接酶。T4DNA聚合酶的功能是补平dscDNA的末端。我们建议做阳性对照，试剂盒中提供人类骨骼肌的mRNA。

1.建议进行阳性对照,cDNA的质量取决于制备的polyA+RNA的质量。非哺乳动物样品的mRNA大约在0.5－3kb之间。

2.通过电泳检测cDNA的产量，与对照进行对比，这样可以有利于在以后的步骤中对cDNA进行稀释。

3.按照程序进行连接反应。

4.如果没有对比样品和对照的产量，利用Tricine－EDTAbuffer制备接头连接的dscDNA的1/50和1/250的稀释物，用两种稀释物进行RACEPCR反应，直到鉴定出哪一种稀释可以得到好的效果。

目前遇到的问题及解决方法

实验中发现，做RACE反应实验实际操作中仍存在不少困难。因此，对RACE反应条件进行反复摸索是十分必要的。这是因为：

1.在5'-RACE包含了有3个连续的酶反应步骤（反转录、同聚物加尾和PCR扩增），每一步都可能导致失败；

2扩增DNA末端的特异性完全依赖锚定引物及扩增DNA模板样品的不均一性，因而特异性一般很低，常呈现不清晰的成片条带或截短的产物背景。因此，使用RACE技术扩增得到的特异末端片段，所获得的重组克隆最好能够全部测序，以排除RACE实验结果中扩增产物假阳性和假阴性，最终有可能获得新基因的全序列。

随着RACE的不断改进和完善，优化条件下PCR扩增效率和忠实性的提高及PCR产物克隆技术的迅速发展，RACE必将在基因克隆及基因表达研究中发挥越来越大的作用。

RACE的另一种代表方法-Self-Ligation法

反转录(RT)反应------Hybrid RNA的分解------单链cDNA的自身连接------PCR扩增5'未知区域------目的DNA片段的切胶回收------DNA序列测定

克隆和测序

1.可以利用胶回收试剂盒来回收RACE产物，此试剂盒适合回收2.5kb以下的RACE产物；对于长的片段，可以通过电洗脱获得好的结果。如果你选择使用其他的纯化方法，最后用Tricine－EDTAbuffer30μl重新悬浮DNA样品。2、电泳5μl回收的样品来鉴定回收的质量。

3.将回收的PCR产物直接克隆到/A型的PCR克隆载体中。另外还可以利用接头和/或cDNA合成引物中的Not1、Srf1、Xma1、ECOR1等酶切位点，将产物克隆到常规载体中。

4.对于5‘端的RACE产物，我们建议挑取至少8－10个不同的克隆以获得5‘端的最大可能性的序列。（反转录并不总是进行到mRNA模板的5’末端，尤其是长模板。另外，T4DNA聚合酶会移走5‘末端的0－20个碱基。）

5.一旦鉴定了含有插入片断的克隆，应该获得多的序列信息。理想的是，可以对整个开放读码框进行测序。包括5‘和3‘的非翻译区。

cDNA的获得

通过部分或全部测序鉴定了RACE产物后，可以通过两种选择获得全长的cDNA。通过PCR和克隆的方法。通过PCR的方法获得全长cDNA：

1.扩增长的cDNA需要较长的延伸时间，但是如果延伸的时间过长，可以产生拖带，所以要慎重的设计引物。

2.根据从5‘和3‘RACE产物获得序列信息设计5’和3‘GSP引物。这些引物应该来自cDNA的3’或者5‘的末端，应该是23－28nt长。不应该在引物的末端加上限制性位点，这样会导致高背景。在某些时候可以设计3’和5‘的嵌套引物。但是还是应该先利用一对引物进行PCR反应。

3.进行如下的热循环：

94度30秒

25个循环：

（1）94度5秒

（2）72度2－15分钟

4.延伸的时间应该等于预期的cDNA长度加上2分钟。例如：预期得到6kb的条带，用6＋2＝8分钟的延伸时间。注意：如果没有条带或者条带弱，增加5个循环；或者优化PCR的条件。

5.在1.2%的琼脂糖凝胶上分析5μl的样品。通常情况下，可以见到一条单一带，如果这样，利用胶来纯化全长的cDNA。

6.制备1.2%的TAEbuffer制备琼脂糖凝胶。不使用TBEbuffer，TBE的胶很难制备全长的cDNA。

7.将剩下的45μl反应物点样，选用适当的marker。

8.利用长波紫外观察cDNA（≧300nm）切下全长的cDNA。注意：应该尽量减少紫外对cDNA的照射。

9.利用胶回收试剂盒回收cDNA。此试剂盒适合回收2.5kb以下的RACE产物；对于长的片段，可以通过电洗脱获得好的结果。如果你选择使用其他的纯化方法，最后用Tricine－EDTAbuffer30μl重新悬浮DNA样品。

10.将全长的cDNA克隆到T/A型的PCR克隆载体中。

通过克隆产生全长的cDNA：

1.如果你已经获得了含有重叠部分的5‘和3’RACE产物，同时在cDNA的重叠部分含有一个酶切位点的话，通过克隆技术可以获得全长的cDNA。

2.利用酶切获得的3‘和5’扩增产物，并且利用T4DNA连接酶将它们连接起来。利用接头和cDNA合成引物中的内切酶将最终的全长cDNA克隆到载体中。

3.在哺乳动物基因组中，NOT1和Srf1酶切非常稀少，大约106bp才出现一次，因此在绝大多数的cDNA中是不出现的。

参考资料